一、 介紹

旨在闡明睡眠在哺乳動物中的作用的電生理研究已有近一個世紀的歷史，但睡眠的功能仍是一個難以捉摸的謎。睡眠狀態(tài)活動的歧視取決于對自由活動的動物的腦電圖（EEG）和肌電圖（EMG）信號的準確確定。腦的EEG記錄可提供有關(guān)神經(jīng)元活動的大量信息，但局限性在于這些測量僅報告了總體的神經(jīng)元放電模式。了解驅(qū)動這些大規(guī)模神經(jīng)元事件的潛在生理機制，需要能夠準確監(jiān)控神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)釋放和攝取的技術(shù)。這樣的技術(shù)可以針對大腦中的特定結(jié)構(gòu)，以補充電生理-臨床研究，現(xiàn)已被認為是研究睡眠作用的重要組成部分。

準確確定睡眠狀態(tài)的主要方法需要同時記錄大腦皮質(zhì)區(qū)域的EEG記錄和肌肉EMG活性的同時測量。腦電圖痕跡反映了植入顱骨的兩個獨立電極之間的微伏電位差。潛在的大小差異為50至200 lV神經(jīng)元放電引起的膜電位變化的結(jié)果活動。腦電信號的頻率也反映了神經(jīng)元的活動。高頻（> 12 Hz）腦電圖表明活躍，*不同的神經(jīng)元激活通常與清醒有關(guān)。高放大器波形（> 100 lV），低頻（<5 Hz）腦電活動，例如在慢波（SW）睡眠期間觀察到的現(xiàn)象表示皮層神經(jīng)rons以高度同步的節(jié)奏射擊。腦電圖具有5-8 Hz的頻率，其幅度小于100 lV，通常表現(xiàn)為快速眼動（REM）睡眠。肌電圖激活通過在肌肉中放置兩個獨立的電極進行測量，可以反映神經(jīng)元激活產(chǎn)生的電位與肌肉收縮有關(guān)。高振幅肌電圖反映活動運動，而強音肌電圖信號表明靜止或睡眠。

盡管測量大腦和肌肉的電活動可以指示睡眠狀態(tài)，但不能提供神經(jīng)化學(xué)功能的指示。要更好地了解滲透生理，就需要同時測量EEG記錄旁的神經(jīng)遞質(zhì)活性。L-谷氨酸，大腦中醉豐fu的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，據(jù)信在睡眠過程中起著重要但尚未定義的作用。先前的大鼠研究表明，睡眠狀態(tài)之間的L-谷氨酸水平發(fā)生了變化REM睡眠過程中前額葉皮層區(qū)域的細胞外L-谷氨酸濃度增加。

量化與睡眠同時發(fā)生的時間的函數(shù)的神經(jīng)遞質(zhì)濃度并非易事。傳統(tǒng)上，這種采樣是通過微透析完成的或驗尸技術(shù)，例如免疫組織化學(xué) 或放射自顯影。這些技術(shù)中的每一個都可以提供有用的數(shù)據(jù)，但是所有這些技術(shù)都有類似的局限性，包括無法實時監(jiān)視神經(jīng)遞質(zhì)（例如缺乏時間分辨率），以及正在監(jiān)視的空間的新生平衡（局部環(huán)境）受到干擾。例如，微透析可提供數(shù)小時或數(shù)天的采樣，但通常僅限于每個樣品不超過1-5分鐘的速率。在微透析過程中，從當?shù)丨h(huán)境中去除分析物會擾亂自然平衡，并且樣品的采集后處理非常費力。驗尸技術(shù)的局限性在于每只動物只能產(chǎn)生一個可用的時間點，而犧牲的必要步驟會干擾睡眠的測量[8b]。也嘗試過將非侵入性技術(shù)（例如MRI）與EEG記錄同時使用，但是這些技術(shù)要求動物在整個采樣期間保持固定狀態(tài)。

同時測量腦電圖，肌電圖和L-谷氨酸生物傳感器的記錄非常適合量化睡眠過程中神經(jīng)遞質(zhì)釋放的每秒變化，而不會干擾局部環(huán)境的平衡。生物傳感器采用生物識別元件（通常是酶）來產(chǎn)生電活性物質(zhì)，然后在轉(zhuǎn)導(dǎo)元件上將其氧化。在L-谷氨酸生物傳感器的情況下，極化至0.6 V的Pt-Ir電極涂在含有生物元素L-谷氨酸氧化酶的基質(zhì)中。生物傳感器周圍細胞外空間中的谷氨酸鹽被L-谷氨酸氧化酶轉(zhuǎn)化為*（H2O2）。酶產(chǎn)生的H2O2然后通過各種膜層擴散到Pt–Ir表面，在此被氧化，產(chǎn)生可測量的安培電流。

睡眠剝奪儀  型號：XR-XS108

近的研究強調(diào)了在大鼠模型中結(jié)合EEG和EMG記錄以及同時進行生物傳感器測量的有效性。這些研究報告了蘇醒期間谷氨酸能活動的升高和REM睡眠發(fā)作期間谷氨酸水平的顯著升高。無一例外，所有這些研究都是使用大鼠作為模型生物進行的。由于大鼠的體型大，它對生理學(xué)研究是有利的，但是這些研究的結(jié)果很難用于基礎(chǔ)遺傳學(xué)。憑借其作為遺傳模型的用途，小鼠是研究睡眠的強大得多的手段。

二、實驗前期準備

小鼠在手術(shù)前至少12小時光照12小時黑暗周期（LD 12:12）下飼養(yǎng)。在整個實驗中，所有小鼠均保持在LD 12:12，食物和水可自由飲用。

三、手術(shù)方法

使用氯an酮（100 mg/kg））甲苯噻嗪（10 mg/kg）對小鼠進行麻醉，并通過外科手術(shù)植入電極進行EEG和EMG記錄。將一根帶有金屬絲的不銹鋼螺釘放置在額骨區(qū)域（A/P -1.0 mm，M/L-1.5毫米）和兩根帶電線的螺釘置于后腦上方（A/P：3.0毫米，M/L±1.5毫米）。使用雙Pt-Ir電極監(jiān)測EMG活性，該電極部分涂有特氟隆，兩側(cè)插入頸背區(qū)域（頸部）肌肉。所有電極引線均連接至預(yù)制的頭戴式支架，并用牙科丙烯酸酯密封樹脂。

四、EEG/GEMG數(shù)據(jù)收集

提供了一個預(yù)放大器單元，牢固地連接到鼠標頭枕上第yi級放大（100*）和初始高通濾波（對于EEG，一階0.5 Hz，對于EMG是10 Hz）。然后將信號通過系鏈和低扭矩換向器連接到上海欣軟信息科技有限公司的腦電肌電采集系統(tǒng)。放大器調(diào)節(jié)單元提供了額外的50信號放大，額外的高通濾波和8階橢圓低通濾波器（50 Hz EEG和200 Hz EMG）。然后，以500 Hz采樣信號，使用14位AAD轉(zhuǎn)換器將其數(shù)字化，然后通過USB路由至基于PC的采集和分析軟件包。從本質(zhì)上講，小鼠是夜行性動物，其晝夜節(jié)律使得在“熄燈”期間可以觀察到大多數(shù)喚醒活動。通常在“開燈”期間觀察到睡眠，尤其是REM睡眠。在“熄燈”期開始后連續(xù)收集了EEG，EMG信號。實驗的前12小時（“熄燈”）專門用于傳感器磨合和建立穩(wěn)定的生物傳感器信號。在接下來的12小時內(nèi)（“點亮”），對應(yīng)于SW和REM睡眠量多的時期，收集了EEG，EMG數(shù)據(jù)進行分析。